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AlphaFold2 (AF2) 通过准确展望卵白质的单一构造彻底改变了构造生物学。然而，卵白质的生物学功能通常取决于多种构象亚状况，而致病的点渐变往往会导致这些亚状况内的种群变化。
来自布兰迪斯大学和霍华德·休斯医学研讨所（Brandeis University and Howard Hughes Medical Institute）、哈佛大学和剑桥大学的研讨团队，研讨证明通过序列相似性对多序列比对 (MSA) 从事聚类，使 AF2 能够以高置信度对已知变形卵白（metamorphic protein）的交替状况从事采样。运用 AF-Cluster 格式，研讨职员研讨了变形卵白 KaiB5 的展望构造的退化分布，发现两种构象的展望都分布在 KaiB 家属的簇中。
研讨职员运用核磁共振 (NMR) 光谱来证实一个令人惊讶的 AF-Cluster 展望：蓝藻 KaiB 变体稳定在与更广泛研讨的变体相反的状况。
为了尝试 AF-Cluster 对点渐变的敏感性，设计并通过实验验证了一组 3 个渐变，预计会将球形红杆菌的 KaiB 从基础状况翻转到折叠变换状况（from the ground to the fold-switched state）。最后，在没有已知折叠变换的卵白质家属中筛选替换状况，确定了结核分枝杆菌中氧化还原酶 Mpt53 的假定替换状况。这种生物信息学格式与实验的进一步发展可能会对展望卵白质能量景观产生深远影响，这对于阐明生物功能至关重要。
该研讨以《Predicting multiple conformations via sequence clustering and AlphaFold2》为题，于 2023 年 11 月 13 日发布在《Nature》上。
论文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-023-06832-9
要了解卵白质功能的机制基础，就需要了解它可能采用的完全的构象亚态。对于任何卵白质构造展望格式，展望集合（ensemble）的任务可以分为两部分：理想的格式将（1）生成包含完全景观的构象，以及（2）根据基础玻尔兹曼分布对这些构象从事评分。
AlphaFold2 (AF2) 在 CASP14 竞赛中取得突破性表现，部分原因在于推进了推断 MSA 中相关序列之间相互作用模式的最先进技术，这建立在推断这些模式（通常称为退化耦合）的格式基础上。基于退化耦合的构造推断格式的前提是，由于氨基酸在 3D 构造的背景下存在和退化，它们不能自由地独立退化，而是以反映基础构造的模式共同退化。然而，卵白质必须在它们采用的多种构象状况的背景下退化。
AF2 在单构造展望方面前所未有的准确性，引起了人们对其展望卵白质多种构象的能力的兴趣，但 AF2 已被证明无法运用其默认设置来展望变形卵白、具有 apo/holo 构象变化的卵白质以及其他多状况卵白质的多种构造。
为什么对 MSA 从事二次采样会展望多种构象状况？这种格式在给定系统中的成功意味着，当运用完全的 MSA 计算退化耦合时，多个状况的退化耦合已经充分存在，因此当 MSA 从事子采样时，引入的噪声会掩盖这些接触的子集，仍然有足够完全的接触集对应于一个或另一个状况。
假设变形卵白将是一组有用的模型卵白，可用于开发展望构象整体的格式，因为它们会经历特别显著的构象变化。例如，虽然变形卵白 KaiB 仅包含 108 个残基，但它会发生构象变化，影响其 C 端部分大约 40 个残基的二级构造，在典型的硫氧还卵白样构造和独特的替换构象之间切换。不到 10 个变形卵白家属经过彻底的实验表征，它们具有多种功能。卵白质中的折叠变换控制转录调节（大肠杆菌中的 RfaH）、昼夜节律（蓝细菌中的 KaiB）、酶活性（M.janaschii 中的选择酶金属肽酶）、细胞信号传导（人类中的趋化因子淋巴趋化素）和细胞循环检查点（人类中的 Mad2）。
对 PDB 的计算分析确定了共享相同序列的卵白质模型之间二级构造的变化，表明所有卵白质中有 0.5-4% 是折叠变换的。开发识别折叠变换卵白的系统格式将有助于识别新的折叠变换卵白，突出新的构造和相互作用以用于治疗，并阐明已知和潜在的卵白质构造、功能和退化历史的更广泛原理。这些原理是已知和尚未发现的变形卵白的基础。
假设，如果能够在不添加先验知识的情况下对退化耦合集从事反卷积，并将这些集单独输入到 AF2 中，AF2 可能能够以高构造精度展望多种构象。研讨职员证明了一种简单的 MSA 子采样格式（通过序列相似性对序列从事聚类）允许 AF2 展望变形卵白 KaiB、RfaH 和 Mad2 的两种状况。
重要的是，研讨表明，运用新格式「AF-Cluster」，通过 AF2 学习的展望局部距离差异尝试 (plDDT) 测量，可以对两种状况从事高置信度采样和评分。研讨确定了 AF-Cluster 展望多个状况的原因：通过对精心策划的系统发育树中的 KaiB 变体从事 AF-Cluster 展望，发现展望折叠到一个或另一个子状况的 KaiB 变体在整个系统发育树中分布在簇中。
研讨职员认为非常有必要对 Thermosynechococcus elongatus pestitus 中的一种新 KaiB 变体从事实验尝试 AF-Cluster 展望，该变体被展望为有利于折叠变换 (FS) 状况。运用 NMR，可以验证 AF-Cluster 展望。为了尝试 AF-Cluster 展望点渐变对卵白质构象平衡切换的影响的能力，研讨职员展望并验证了一组最小的点渐变，这些点渐变将来自球形红杆菌的 KaiB 在基态和 FS 状况之间切换。
图示：AF-Cluster 展望卵白质 RfaH 和 Mad2 的折叠变换。（来源：论文）
在对已知变形卵白评估 AF-Cluster 格式后，研讨职员接下来假设该格式可能能够检测未知构造的卵白质家属中的替换构象。将 AF-Cluster 应用于与晶体构造相关的现有 MSA 数据库。在这里描述了筛选出的一个候选者具有一种新的展望交替折叠，即结核分枝杆菌分泌的氧化还原酶 Mpt53。结果表明，在即将到来的 AF2 构造生物学时代，任何给定卵白质靶点的相关序列可能包含多个生物学相关构造的信号，并且深度学习格式可用于检测和分析这些多种构象状况。